Преимплантационная генетическая диагностика методом сравнительной геномной гибридизации — новый подход в профилактике рождения детей с врожденной и наследственной патологией в рамках программы ВРТ

Достижением вспомогательных репродуктивных технологий является рождение здорового ребенка. С учетом современных требований это достигается путем селекции и переноса единственного здорового эмбриона в полость матки.

Отбор эмбрионов позволяет проводить преимплантационная генетическая диагностика. Авторами статьи проведен обзор существующих методов диагностики, применимых в программах вспомогательных репродуктивных технологий. На основании литературных данных проведен научный сравнительный анализ методов генетической диагностики.

Показано, что наиболее информативным является современный метод геномной гибридизации CGH (Comparative Genomic Hybridization), позволяющий провести оценку всех хромосом бластомера. Данный метод превосходит по своим возможностям метод флуоресцентной гибридизации FISH, позволяющей изучить только определенное количество хромосом.

В своих исследованиях неразвивающегося хориона авторы представили данные, доказывающие необходимость проведения диагностики методом CGH, позволяющим изучить все хромосомы и понять причину замирания беременности

Однако, при внедрении CGH, как метода преимплантационной генетической диагностики, число циклов ВРТ с переносом эмбрионов снижается, но в то же время, это позволяет выбрать один генетически здоровый эмбрион для переноса и рождения здорового ребенка.

Раннее выявление генетических мутаций и предупреждение рождения детей с врожденной и наследственной патологией были и остаются актуальной проблемой общества и современной медицины. Последние десятилетия ознаменованы активным развитием новых технологий и методов исследования в области профилактики генетических нарушений плода. Это вызвано несколькими основными факторами: 1) в структуре перинатальной смертности и заболеваемости новорожденных врожденная и наследственная патология занимает 2-3 место [1]; 2) изменилось репродуктивное поведение человека. Зачастую, возраст перворожениц стал превышать 35 лет; 3) изменилась экологическая обстановка во всем мире; 4) можно предположить, что благодаря достижениям в области вынашивания стали рождаться дети с определенными хромосомными мутациями; 5) широкое применение в медицинской практике методов вспомогательной репродуктивных технологий (ВРТ), которые также могут способствовать передачи мутаций потомству, являющихся причиной бесплодия.

Такие опасения вызваны результатами исследования кариотипа у 430 детей, рожденных в программе ЭКО/ИКСИ, которое показало у 15 (3.5%) из них были хромосомные изменения, а в контрольной группе из такого же числа детей, рожденных естественным путем, не было выявлено ни одного случая хромосомной патологии [2].

Кроме того, с 2002 года в печати стали появляться работы, в которых авторы сообщают о случаях рождения в программе ЭКО детей с возникшими de novo заболеваниями геномного импринтинга: синдромами Видемана-Беквита, Энгельмана и др., которые не диагностируются стандартными цитогенетическими методами пренатальной диагностики, и для выявления которых во время беременности требуется достаточно сложное комплексное обследование [3, 6, 19, 24].

Новые условия требуют создания новых подходов к разработке профилактики врожденной и наследственной патологии и рождения здорового потомства у пациентов, включенных в программу ВРТ.

Новым и исключительно перспективным направлением в клинической практике в плане исключения рождения генетически больного ребенка должна стать преимплантационная диагностика, большим преимуществом которой является исследование эмбриона до момента переноса его в организм матери [15, 22].

В настоящее время большинство медицинских центров для ПГД применяют молекулярно-цитогенетический (FISH) и молекулярный (ПЦР) методы исследования.

FISH метод является методом быстрого проведения генетического анализа и дает возможность получить результат в короткое время [20]. С помощью этого метода по флуоресценции зондов можно определить структурные перестройки хромосом и выявить число копий хромосом в интерфазных ядрах. Однако этим методом можно оценить ограниченное количество хромосом. Большинство клиник используют набор реактивов (зонды), которые позволяют проанализировать хромосомы Х, Y, 13, 18, 21 (самые частые анеуплоидии) [21].

Применяя технику ПЦР, можно диагностировать заболевания, связанные с доминантными и рецессивными мутациями в уникальных генах, определять антигены системы HLA, а также резус принадлежность эмбрионов.

Все вышесказанное еще раз указывает на необходимость поиска новых методов диагностики эмбрионов с целью исключения у них генетической патологии и широкого внедрения этих методов в медицинскую практику не только у пациентов с нарушением репродуктивной функции, но и у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения потомства с генетическими изменениями.

Одним из современных генетических методов исследования является метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative Genomic Hybridization — CGH). Принцип метода основан на конкурентной гибридизации in situ двух геномных образцов (один получен из анализируемой ткани (или единичных клеток), второй — контрольной) с array платформой (ДНК-проба, нанесенная на стекло, так называемый чип). Геномные образцы предварительно мечены разными флуорохромами. Заключение о количестве копий хромосомного материала делают по интенсивности свечения флуорохромов в каждом участке хромосомы. Важные преимущества метода - одновременно одна реакция гибридизации позволяет осуществить скрининг генома на предмет анеуплоидий и несбалансированных хромосомных перестроек; другое - не требуется предварительное культивирование материала, приготовление хромосомных препаратов. Эти преимущества позволили применять данный метод в преимплантационной генетической диагностике. Исследование полностью автоматизировано и в настоящее время может быть осуществлено в течении 24 часов.

Однако данный метод имеет и ряд ограничений связанный с феноменом мозаицизма и хаотичным хромосомным набором в эмбрионе на ранних стадиях эмбриогенеза. Кроме того, данный метод не позволяет выявить плоидность клеток. Результаты FISH исследования бластомеров показали, что 10-15% клеток могут быть гаплоидными или полиплоидными [13]. Кроме того, данный метод не всегда пригоден для диагностики у пациентов, имеющих в кариотипе сбалансированную транслокацию (если размер транслоцируемого участка хромосомы менее 2-5 млн. пн, зависит от array платформы).

Для проведения ПГД CGH методом могут быть использованы полярные тельца, бластомеры и клетки трофэктодермы [9, 16, 17, 18, 26]. Для диагностики используют различные array платформы: CytoChip Version 3.0; 24Sure Version 2.0; 24sure; 24sure+ ; Исследование методом CGH можно разделить на несколько этапов:

• полная геномная амплификация полученной клетки (Whole genom amplificarion - WGA);
• контроль качества полученной исследуемой ДНК;
• мечение контрольной и исследуемой ДНК;
• концентрация ДНК перед гибридизацией;
• гибридизация исследуемой и контрольной ДНК с array платформой;
• отмывка образца после гибридизации;
• сканирование array платформы с образцами, анализ результата.

В настоящее время сформулированы основные показания для ПГД

• Пары, у которых в анамнезе были случаи рождения детей с наследственной и врожденной патологией;
• пары, в кариотипе которых имеются сбалансированные хромосомные аберрации;
• пары, возраст которых превышает 35 лет;
• пары, в анамнезе которых было 2 и более неудачных попыток ЭКО;
• пары, у которых в анамнезе были случаи пузырного заноса, невынашивание беременности;
• пары, с мужским фактором бесплодия;

В настоящее время оценке исходов программ ВРТ, где проводилась ПГД методом CGH, уделяется много внимания. Это связано с тем, что в печати имеются работы с противоречивыми данными об уровне имплантации и исходов программ ВРТ с ПГД методом FISH.

По мнению одних авторов скрининг эмбрионов не увеличивает шансы наступления беременности, по мнению других, способствует этому. В своем обзоре доктор Harper J.C [14] предполагает, что это может быть связано именно с методом FISH, который не позволяет анализировать анеуплоидии одновременно всех хромосом.

Ученые Колорадского Центра Репродуктивной Медицины исследовали методом CGH 287 бластоцист от 45 пациентов (средний возраст женщин составлял 37,7 лет). Все эмбрионы после биопсии были криоконсервированы. Результат анализа был получен в 93.7% наблюдений, из них 51.3% эмбрионов были с анеуплоидией. При переносе 90 размороженных эмбрионов беременность наступила в 82.2% случаях, что сравнимо с группой контроля (84%), несмотря на то, что в исследуемой группе эмбрионов было перенесено на 25% меньше [25].

В исследовании Yang Z. с соавт. [27] уровень выявленной анеуплоидии в ядрах трофэктодермы составил 44.9%, при этом моносомии - 35.1%; трисомии -20.0%.

Процент наступления беременности после диагностики составил 70.9%, в группе контроля, где переносились эмбрионы визуально хорошего качества без ПГД - 45.8%.

По мнению Alfarawati S. c соавт. [5] морфология эмбрионов на стадии бластоцисты не может являться точным критерием генетического здоровья эмбрионов, хотя авторы и отмечают слабую ассоциацию морфологии с анеуплоидией, считают, что нельзя быть до конца уверенными при переносе бластоцист, полагаясь только на этот критерий. В своем исследовании они показали, что 56,7% бластоцист были с анеуплоидией.

Кроме того, внимание репродуктологов направлено на селекцию и перенос одного единственного здорового эмбриона в полость матки и получение беременности одним плодом, так как вынашивание многоплодной беременности связано с акушерскими осложнениями.

Многие авторы делают заключение, что скрининг эмбрионов полезен для достижения этой цели. При переносе 2-3 эмбрионов после ПГД Schoolcraft W.B. [25] с соавт. отметили, что в 57% наблюдений наступает многоплодная беременность. Yang Z. с соавт. [27] в своей работе рекомендует селективно переносить как можно меньше эмбрионов с учетом возраста, анамнеза и проведенных ранее циклов, при этом предварительно проводить ПГД. При переносе только одного эмбриона после ПГД беременность получена в 70.9% случаев.

Исследователи отметили высокий уровень имплантации эмбрионов у пациентов с ранее неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Так Schoolcraft W.B с соавт. отметили, что из 90 перенесенных эмбрионов после ПГД методом CGH, имплантировалось 65 (72,2%), а в группе контроля этот показатель составил всего 46,5% (в 6,5 недель беременности по данным ультразвукового исследования)[25].

Супружеские пары программы ВРТ с изменениями в кариотипе представляют самую сложную группу, нуждающихся в преимплантационной диагностике пациентов.

Носители сбалансированных хромосомных транслокаций в кариотипе имеют высокий риск рождения детей с хромосомной патологией, у них часто наблюдается невынашивание беременности из-за появления у потомства несбалансированных транслокаций. Проведение ПГД у этой группы пациентов представляется самой трудоемкой диагностикой. Для диагностики каждого вида хромосомных транслокаций FISH методом требуется приготовление индивидуальных зондов в условиях лаборатории, проводящей диагностику.

При проведении преимплантационной диагностики у пациентов с изменениями в кариотипе необходимо учитывать тот факт, что у них формируются гаметы с мутациями de novo, использование которых в программе ЭКО, ИКСИ может привести к рождению ребенка с хромосомной патологией. Следовательно, помимо исследования эмбрионов на анеуплоидии хромосом, вовлеченных в транслокации, необходимо дополнительно исследовать их на самые распространенные хромосомные нарушения (синдромы Дауна, Патау, Эдвардса).

ПГД у пациентов с нарушением в кариотипе является одним из главных звеньев в алгоритме профилактических мероприятий по предотвращению не только рождения больного ребенка в таких семьях, но и предотвращению у них возникновения беременности больным плодом.

О пользе одновременного исследования 24 хромосом у пациентов с аберрациями кариотипа отметил Fiorentino F. с соавт. [8]. Они проводили ПГД методом CGH в 28 циклах у 24 пар с 18 различными перестройками хромосом. Возраст женщин был меньше 43 лет (средний возраст 37 лет). Из 200 подвергшихся биопсии эмбрионов 3 дня развития у 187 был получен результат (93.5%). Пригодные для переноса эмбрионы были диагностированы в 17 циклах (60.7%) всего было перенесено 22 эмбриона. У 12 пар наступила клиническая беременность (70.6%), при этом уровень имплантации составил 63.6% (2 двойни, 10 одноплодных беременностей). На момент написания статьи 3 детей были рождены, остальные беременности были сроком гестации более 20 недель. Диагностика методом CGH показала, что 16% эмбрионов были нормальными или сбалансированными по всем хромосомам; 17.1% были несбалансированными по хромосомам вовлеченным в транслокацию и нормальными по остальным хромосомам; 39.6% были одновременно несбалансированны и имели анеуплоидии хромосом не вовлеченных в транслокацию.

Colls P. с соавт. [7] считают, что метод CGH больше подходит для ПГД у пациентов с транслокациями в кариотипе. Это заключение было сделано после обследования 402 эмбрионов у супружеских пар с различными аберрациями в кариотипе. Результат был получен у 98.1% эмбрионов. Анализ результатов показал: 20.2% ядер были нормальными или сбалансированными; 22.9% - несбалансированными, но эуплоидными; 30.6%- несбалансироваными и анеуплоидными и 26.4% сбалансированными, но с анеуплоидией. На основании полученных данных, авторы считают необходимостью обследовать эмбрионы одновременно на транслокации и анеуплоидии хромосом, не вовлеченных в аберрацию. Похожие результаты были получены Alfarawati S. c соавт. [5] Уровень пригодных для переноса эмбрионов составил 22.3%. Патология распределилась следующим образом: 21.5% эмбрионов были несбалансированы только по хромосомам, вовлеченными в транслокацию; 27.3% - несбалансированными и анеуплоидными; 28.9% - сбалансированными, но с анеуплоидией. Процент наступления беременности на цикл в данном исследовании составил 26.3, а на перенос эмбриона — 45.5%.

Анализ проведения ПГД методом CGH в нашей лаборатории показал, у этой категории пациентов до 30% случаев могут быть циклы без переносов эмбрионов. Следует отметить, что отмена переноса может быть по причине не только того, что в эмбрионах несбалансированные варианты генетического материала хромосом вовлеченных в транслокацию, но и по причине анеуплоидий других хромосом, не вовлеченных в транслокацию. Уровень анеуплоидий хромосом у пациентов с транслокациями доходил до 38%, сочетанная патология (несбалансированная транслокация+анеуплоидии по другим хромосомам) до 25%.

ПГД FISH методом у пациентов с невынашиванием беременности может снизить частоту спонтанных выкидышей до общепопуляционных показателей. У пациентов с выкидышами в анамнезе уровень спонтанных абортов удалось снизить до 16.7%, против ожидаемых 36.5%, у женщин старше 35 - до 12%, против ожидаемых 44.5% [23].

Проведенные собственные исследования позволили нам придти к заключению, что исследование хориона неразвивающейся беременности после программ ВРТ является так же необходимым важным этапом.

Нами были исследованы методом CGH хорионы неразвивающихся беременностей после программы ЭКО у пациентов с нормальным кариотипом. Результаты показали, что синдром Тернера встречался в 31,6% наблюдений от общей патологии, анеуплоидии по аутосомам составили - 68.4%. Следует отметить, если бы этим пациентам до переноса эмбрионов была проведена ПГД методом FISH, стандартным набором для генетического скрининга, то в 42% наблюдений был бы перенос эмбрионов с генетической патологией, так как хромосомная патология, выявленная в неразвивающемся хорионе, была представлена хромосомами, не включенными в этот набор.

Ряд авторов считают, что исследование первых и вторых полярных телец методом CGH может служить надежными предикторами плоидности зиготы [10].

Кроме того, применение метода CGH открывает новые возможности в понимании процессов сегрегации хромосом во время мейоза в стимулированных циклах. Handyside A.H. и группа ученых исследовали 1, 2 полярные тельца, зиготы у возрастных женщин программы ВРТ, и показали ошибки материнского происхождения. Данные указывают на то, что анеуплоидии возникали как в мейозе 1, так и в мейозе 2. Однако на долю вторых, приходилась большая половина, в зиготах же, в основном, наблюдалась анеуплоидия сразу нескольких хромосом [11,12].

Заключение

В настоящее время, прогресс в развитии микроманипуляционной техники и методов лечения НРФ, к сожалению, опережает разработку и внедрение методов профилактики рождения здорового потомства. С учетом того, что среди пациентов с НРФ генетическая патология встречается чаще, чем в популяции, профилактические мероприятия должны стать неотъемлемой частью при проведении программы ВРТ. В связи с вышесказанным, разработкам в области преимплантационной диагностики в последнее время уделяется большое внимание.

Особенностью ПД является то, что в семьях с высоким риском рождения больного ребенка появляется возможность перейти от вероятностного прогнозированию исхода беременности к однозначному.

Преимплантационная диагностика может стать альтернативой пренатальной диагностике для фертильных супружеских пар имеющих высокий риск рождения ребенка с наследственной или врожденной патологией, которые в случае обнаружения у плода генетической патологии выступают против медицинского аборта по моральным, религиозным или другим мотивам.

Все вышесказанное указывает на то, что метод CGH может быть успешно применен в преимплантационной диагностике на разных стадиях развития эмбриона и полярных тельцах.

Preimplantation genetic diagnosis by CGH - a new approach to prevention births with congenital and hereditary diseases in ART.

J. Glinkina, G.Makhmudova, M. Kibanov

The purpose of assisted reproductive technologies is the birth of a healthy baby. With the current requirements is achieved by the selection and transfer only healthy embryos into the uterine cavity.

Selection of embryos performed with using preimplantation genetic diagnosis. The authors reviewed and comparatively analysed of the modern genetic diagnostic methods applicable in assisted reproductive technologies and .

It was shown that the most informative is the method of genomic hybridization CGH (Comparative Genomic Hybridization), allowing to evaluate all chromosomes of the blastomere. This method is more capabilities than fluorescent hybridization (FISH) allowing to study only a several chromosomes.

In the own studies, the authors presented that the chorion of the missed abortion need the diagnosis by CGH, for study all the chromosomes and determine the cause of the missed abortion

However, the introduction of CGH, as a method of preimplantation genetic diagnosis, the number of ART cycles with embryo transfer is reduced, but at the same time, it allows you to select a healthy embryo for transfer and than for birth of the healthy baby.

Список используемых источников

• Кулаков В, Барашнев В, Бахарев В. Профилактика и пренатальная диагностика врожденной патологии плода и новорожденного. Пособие для врачей. М. 2003: 5
• Aboulghar H. A prospective controlled study of karyotyping for 430 consecutive babies conceived through intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 2001; vol. 76 (2); 249 – 253
• Allen C. Assisted reproduction technology and defects of genomic imprinting. BJOG. 2005 112 (12): 1589 - 1594
• Alfarawati S, Fragouli E, Colls P et all. First births after preimplantation genetic diagnosis of structural chromosome abnormalities using comparative genomic hybridization and microarray analysis. Human Reproduction. 2011 Jun 26(6): 1560-74
• Alfarawati S, Fragouli E, Colls P et all. The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender. Fertility and Sterility. 2011 Feb 95(2):520-4
• Arnaud P. Epigenetic deregulation of genomic imprinting in human disorders and following assisted reproduction. Birth. Defects. Res. C. Embryo. Today. 2005 75 (2): 81-97
• Colls P, Escudero T, Fischer J et all. Validation of array comparative genome hybridization for diagnosis of translocations in preimplantation human embryos. Reprod Biomed Online. 2012 Jun; 24(6): 621-9
• Fiorentino F, Spizzichino L, Bono S et all. PGD for reciprocal and Robertsonian translocations using array comparative genomic hybrization. Human Reproduction. 2011 Jul 26(7): 1925-35
• Fragouli E, Escalona A, Gutierrez-Mateo C et all. Comparative genomic hybridization of oocytes and first polar bodies from young donors. Reprod Biomed Online. 2009 Aug 19(2): 228-237
• Geraedrs J, Montag M, Magli M et all. Polar body array CGH for predition of the status of the corresponding oocyte. Part I: clinical results. Human Reproduction. 2011 Nov 26(11): 3173-80
• Handyside A. Molecular origin of female meiotic aneuploidies. Biochim Biophys Acta. 2012a 1822(12):1913-20
• Handyside A, Montaq M, Magli M et all. Multiple meiotic errors caused by predivision of chromatids in women of advanced maternal age undergoing in vitro fertilization. Evr J Hum Genet. 2012 20(7):742-7
• Harper J, Coonen E, Handyside A et al. Mosaicism of autosomes and sex chromosomes in morphologically normal, monospermic preimplantation human embryos. Prenat. Diagn. 1995 15(1): 41-49
• Harper J, Harton G. The use of arrays in preimplatation genetic diagnosis and screening. Fertility and Sterility. 2010 94 (4): 1173-1176
• Harper J. International data collection. Reprod. Biomed. Online. 2005 10 (2): 5
• Harper J, SenGupta S. Preimplantation genetic diagnosis: State of the ART 2011. Hum Genet. 2012 : 131: 175-186
• Harton G, Munne S. Microarray and CGH for PGD of chromosome abnormalities and gene defects. Practical Manual of In Vitro Fertilization. Spriger. 2012: 483-490
• Jaroudi S, Wells D. Microarray- CGH for the assessment of aneuploidy in human polar bodies and oocytes.Methods Mol Biol. 2013; P 957-983
• Lidegaard O, Pinborg A, Andersen A. Imprinting disorders after assisted reproductive technologies. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2006 18 (3): 293 - 296
• Liu J et all. Polymerase chain reaction analysis of the cystic fibrosis DF 508 mutation in human blastomeres following oocyte injection of a single sperm from a carrier Prenatal Diagnosis. 1993 13: 878 - 880
• Munne S, Fragouli E, Colls P et all. Improved detection of aneuploid blastocysts using a new 12-chromosome FISH test. Reprod Biomed Online. 2010 Jan 20(1): 92-7
• Munne S. Embryonic chromosome abnormalities. Reprod. Biomed. Online. 2005 10 (2): 3
• Munne S, Chen S, Fischer J et all. Preimplantation genetic diagnosis reduces pregnancy loss in women aged 35 years and older with a history of recurrent miscarriages. Fertil. Steril. 2005 84 (2): 331-5
• Rossignol S, Steunou V, Chalas C. et all. The epigenetic imprinting defect of patients with Beckwith-Wiedemann syndrome born after assisted reproductive technology is not restricted to the 11p15 region. J. Med. Genet. 2006 43(12): 902 - 907
• Schoolcraft W , Fragouli E, Stevens J et all. Clinical application of comprehensive chromosomal screening at the blastocyst stage. Fertility and Sterility. 2010 94 (5): 1700-1706
• Vanneste E, Bittman L, Van der Aa N et all. New array approaches to explore single cells genomes. Front Genet. 2012: 3-44.
• Yang Z, Liu J, Collins G et all. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 2012: 5-24

Сводная таблица данных проведения ПГД методом CGH